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克隆形成实验

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平板克隆形成实验基本步骤:

1.取对数生长期的经siRNA干扰24h的结肠癌细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,将细胞重悬于10%胎牛血清的DMEM培养液中备用,同时设置未经siRNA干扰处理的细胞为对照组。


2.将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50,100,200个细胞的密度梯度分别接种于6cm培养皿中,轻轻将细胞摇匀,使细胞均匀分散,置于375% CO2和饱和湿度的恒温培养箱中培养2-4周。


3.经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃掉上清,用PBS小心浸洗2次。用2.5ml4%多聚甲醛固定细胞15min,然后去掉固定液,加入适量GIEMSA应用染色液染10-30min,然后用流水轻轻洗去染色液,空气干燥。


4.将平皿倒置,并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜下计数大于10个细胞的克隆数,最后计算克隆形成率。

克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)*100%

试验时间:4


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